黑龍江干細(xì)胞外泌體提取暨南大學(xué)
黑龍江
干細(xì)胞外泌體提取
暨南大學(xué)
外泌體
外泌體是指包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡 (30-150nm)，現(xiàn)今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。
1983年，外泌體首次于綿羊
網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)， 1987年Johnstone將其命名為“exosome”。
多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。
其主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中 。
黑龍江干細(xì)胞外泌體提取暨南大學(xué)
所有培養(yǎng)的細(xì)胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。
有關(guān)他們分泌和攝取及其組成、“運(yùn)載物”和相應(yīng)功能的分子機(jī)制剛剛開始研究。
外泌體被視為特分泌的膜泡，參與細(xì)胞間通訊，對(duì)外泌體的研究興趣日益增長(zhǎng)，無(wú)論是研究其功能還是了解如何將其用于微創(chuàng)診斷的開發(fā)。
外泌體富含膽固醇和鞘磷脂。
2007年， Valadi等發(fā)現(xiàn)鼠的
肥大細(xì)胞分泌 的 exosome可以被人的肥大細(xì)胞捕獲，并且其攜帶的mRNA成分可以進(jìn)入細(xì)胞漿中可以被翻譯成蛋白質(zhì)，不僅僅是mRNA，exosomes所轉(zhuǎn)移的microRNA同樣具有
生物活性，在進(jìn)入靶細(xì)胞后可以靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞中mRNA的水平。
這一發(fā)現(xiàn)使得研究人員對(duì)exosome的研究熱情激增，截止已經(jīng)通過286項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了41860種蛋白質(zhì)、2838種microRNA、3408種mRNA。
一類外泌體中常見的細(xì)胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一種。
它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與
受體細(xì)胞的融合，有文獻(xiàn)報(bào)道稱RAB4, RAB5和 RAB11主要出現(xiàn)于早期以及回收的核內(nèi)體中，RAB7 和 RAB9主要出現(xiàn)于晚期的核內(nèi)體。
現(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。
除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。
外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63, CD81 和CD9)）、
熱休克蛋白家族（(HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2 和HSP90以及一些細(xì)胞特的蛋白包括A33（結(jié)腸上皮細(xì)胞來(lái)源）、MHC-Ⅱ(
抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)、CD86(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細(xì)胞）。
其它一些外泌體中的蛋白包括多種的代謝類的酶（GAPDH, 烯醇化酶 1, 醛縮酶 1, PKM2, PGK1, PDIA3, GSTP1,DPP4, AHCY, TPL1, 抗氧化蛋白, P4HB, LDH, 親環(huán)素 A,FASN, MDH1 和CNP）、核糖體蛋白（RPS3）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（黑色素瘤分化相關(guān)因子, ARF1, CD2, 人類紅細(xì)胞膜整合蛋白, SLC9A3R1）、粘附因子（MFGE8、整合素）、細(xì)胞骨架蛋白以及泛素等。
外泌體的提取主要包括以下幾種方式。
一是超速離心法，這是外泌體提取最常用的方法 。
此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，電鏡鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊， 由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，也有一些研究認(rèn)為此種 方法得到的是微泡不是外泌體 。
二是過濾離心， 這種操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，不影響外泌體的生物活性 ，但同樣存在純度不足的問題。
三是
密度梯度離心法， 用此種方法分離到 的外泌體純度 高，但是前期準(zhǔn)備工作繁雜，耗時(shí)，量少。
四是
免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態(tài) 的完整，特高、操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設(shè)備，但是非中性pH 和非 生理性鹽濃度會(huì)影響外泌體生物活性， 不便進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn) 。
五是PS親和法，該方法將PS（
磷脂酰絲氨酸）與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。
該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度。
由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。
2016.9 《Scientific Reports》 雜志發(fā)表了該方法數(shù)據(jù)，表明PS法可提取相當(dāng)高純度的外泌體。
六是色譜法，這種方法分離到的外泌體在 電鏡下大小均 一， 但是需要特殊的設(shè)備 ， 應(yīng)用不廣泛 。
