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蛋白磷酸化指蛋白質(zhì)肽鏈上特定氨基酸共價結(jié)合磷酸基團(tuán)的過程，結(jié)合磷酸基團(tuán)的氨基酸的種類以及其處于多肽鏈中的位置就稱為磷酸化位點。真核生物的磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基上，而原核生物磷酸化主要發(fā)生在組氨酸、精氨酸和賴氨酸等殘基上。

利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)LC-MS-MS鑒定磷酸化位點需要先鑒定發(fā)生磷酸化的肽段，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行磷酸化位點分析。基于LC-MS-MS的磷酸化位點鑒定中，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)樣品消化成小片段肽段，由于正常生理條件下磷酸化水平較低，磷酸化肽段豐度也較低，為了提高實驗的靈敏度和準(zhǔn)確性，通常需要對磷酸化的肽段進(jìn)行富集再進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。串聯(lián)質(zhì)譜會測量完整的肽質(zhì)量和碎片離子質(zhì)量，通過分析肽段分子質(zhì)量是否增加了磷酸酯基團(tuán)的質(zhì)量數(shù)來判定該肽段磷酸化與否。在某些情況下檢測到的磷酸化肽段只含有一個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，那么這個氨基酸位點即是磷酸化位點，當(dāng)檢測到的磷酸化肽段含有多個氨基酸殘基時，則需要進(jìn)行二級質(zhì)譜進(jìn)一步確定磷酸化的氨基酸位點。

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